Методы получения изолированных колоний. Принципы и методы выделения чистых культур

Метод Пастера (метод предельных разведений). Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма. Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.

Методы механического разделения микроорганизмов с использованием плотных питательных сред. К таким методам относятся метод Коха и метод Дригальского.

Метод Коха (метод глубинного посева). Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленной плотной питательной средой. Равномерно размешивают содержимое пробирки, вращая ее между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй – в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды в чашках, их помещают в термостат для культивирования.

Для выделения анаэробных микроорганизмов по методу Коха необходимо ограничить доступ кислорода к культуре. С этой целью поверхность глубинного посева в чашке Петри заливают стерильной смесью парафина и вазелина (1:1). Можно также оставлять посевной материал, тщательно перемешанный с агаризованной средой, непосредственно в пробирке. Ватную пробку при этом заменяют резиновой или заливают поверхность агара смесью парафина и вазелинового масла. Чтобы извлечь выросшие колонии анаэробных микроорганизмов, пробирки слегка нагревают, быстро вращая над пламенем горелки. Агар, прилегающий к стенкам, расплавляется, и столбик легко выскальзывает в подготовленную чашку Петри. Далее столбик с агаром разрезают стерильным скальпелем, колонии извлекают стерильной петлей или стерильной капиллярной рубкой и переносят в жидкую среду.

Метод Дригальского основан на механическом разделении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри. Каждая микробная клетка, фиксируясь в определенном месте, начинает размножаться, образуя колонию.

Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой. На поверхность среды вносят каплю исследуемого материала. Затем с помощью стерильного шпателя эту каплю распределяют по всей питательной среде (посев газоном).

Посев также можно проводить штрихом, используя бактериологическую петлю. Этим же шпателем или петлей осуществляют посев во вторую, третью и т.д. чашки. Как правило, в первой чашке после культивирования посева появляется рост микробов в виде сплошного налета, в последующих чашках содержание микроорганизмов снижается и образуются изолированные колонии, из которых отсевом можно легко выделить чистую культуру.

Таким образом, в первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии, представляющие собой потомство одной клетки.

В целях экономии сред и посуды можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на сектора, и последовательно засевать их штрихом (метод истощающего штриха). Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно оставшимися на петле клетками засевают все другие сектора. При каждом последующем штрихе происходит уменьшение количества засеваемых клеток.

Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Например, с помощью этого метода можно выделить чистую культуру туберкулезных микобактерий, устойчивых к действию кислот, щелочей и спирта. В этом случае исследуемый материал перед посевом заливают 15 % раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате в течение 3…4 часов. После воздействия кислоты или щелочи клетки туберкулезной палочки остаются живыми, а все другие микроорганизмы, содержащиеся в исследуемом материале, погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи обработанный материал высевают на плотную среду и получают изолированные колонии возбудителя туберкулеза.

«Получение аммиака» - Обеспечить оптимальное протекание химических реакций. Создании альтернативного способа производства аммиака. Создать производство, основанное на современных принципах. При увеличении температуры равновесие смещается в сторону эндотермической реакции. Химизм. Аппарат для получения аммиака. Принципиальная схема производства.

«Метод проектов» - Давать определение понятиям. Видеть проблемы. Осуществление деятельности. На долю учителя остается трудная задача выбора проблем для проектов. Метод учебных проектов. Оформление проектной папки. Классифицировать. «От идеи до реализации». Задавать вопросы. Распределяют роли в группе. Скажи мне - и я забуду.

«Методы психологии» - Выполните задание. Почему знание социальной психологии способствуют более эффективному взаимодействию людей? Место психологии в системе наук. Зачем нужно изучать психологию? Задачи психологии. Тест «Какой вы психолог?». Психология - наука, изучающая факты, закономерности и механизмы психики. Методы изучения человека.

«Основание греческих колоний» - Как изменились права демоса? А существует ли сегодня в нашем государстве демократия? Почему Солон был вынужден покинуть свое государство на длительный срок? Сделай вывод. Урок на тему: «Основание греческих колоний». Основные причины переселений: Основание греческих колоний. Назовите места колонизации на Средиземном море.

«Получение радиоактивных изотопов» - Получение радиоактивных изотопов. Йод интенсивно отлагается в щитовидной железе, особенно при базедовой болезни. Радиоактивные изотопы широко применяются в науке, медицине и технике. Меченые атомы. С помощью ядерных реакций можно получить изотопы всех химических элементов. Для постановки диагноза, так и для терапевтических целей.

«Метод проектов в литературе» - Метод проектов на уроках литературы. Целеустремленность. Все члены команды равны. Презентация. Такой урок включает в себя приемы и методы различных форм обучения. Каждый должен получать удовольствие от чувства уверенности в себе. Цель нетрадиционных уроков: Все должны проявлять активность и вносить свой вклад в общее дело.

78149 0

Культуральные свойства бактерий

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.

При описании колоний учитывают следующие признаки:
1) форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;

2) размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

3) поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

4) профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;

5) прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

6) цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;

7) край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;

8) структуру колонии - однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;

9) консистенцию колонии; определяют прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.

Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды и температуры культивирования.

Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя четырех-семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях.

В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.

Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.

Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям -относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Исследуемый материал (вода, почва, воздух, пищевые продукты или другие объекты) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, т. е. производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп:
1. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и в дальнейшем при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

3. Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу, на месте посева. Пересевая верхние края культуры, можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках.

С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 суток выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 оС агаризированной питательной среде.

Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды.

Для извлечения изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта. Когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку; среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Цель второго этапа бактериологического метода: получение чистой культуры микроорганизмов и ее накопление. Для этого проводят:

· Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

· Микроскопическое изучение изолированных колоний, а затем приготовление и просмотр мазков из этих колоний.

· Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

Культуральные признаки микробов определяются харак­тером роста их на питательных средах. Будучи постоянными, для каждого вида микроба, они являются важным диагно­стическим признаком.

Выделяя чистую культуру микроорганизма, следует обращать внима­ние на характер роста микроба, т.е. на культуральные особенности как на один из признаков, позволяющий идентифицировать род, вид микроорга­низма. При культивировании микроба на жидких средах, можно видеть рост бактерий в виде:

а) диффузного помутнения;

б) придонного и пристеночного роста в прозрачной среде;

в) поверхностной пленки;

г) «комочка ваты».

В полужидких средах можно наблюдать:

а) диффузный рост вокруг посева уколом (подвижные бактерии);

б) рост по ходу укола (неподвижные бактерии);

в) разрыв среды или образование пузырьков газа.

На плотных средах наблюдается:

а) рост отдельными колониями;

б) рост сплошным налетом.

Рост микробов на плотной питательной среде. Для изуче­ния свойств колоний микробы культивируют на плотных пи­тательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний.

По характеру колоний выделяют следующие типы:

· S-тип (от англ. smooth - гладкий) - колонии характеризуются круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;

· R –тип (от англ. rough – шероховатый) колонии характеризуются шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S -форм в результате мутаций. Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссо­циации. Явление диссоциации у патогенных микробов на­блюдается под действием антибиотико - и химиотерапии, фак­торов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды.

· Помимо этих двух основных типов колоний существует слизистый М-тип (от лат. mucus - слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией. Образуется в процессе диссоциаций бактериальных культур.

Бактерии каждого вида формируют колонии с различными признаками. Их характер изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете, а также с помощью лупы или микроскопа с малым увеличением. В начале исследования чашку поворачивают дном к себе и рассматривают чашки в проходящем свете. При наличии разных колоний каждую из них нумеруют и описывают в отдельности. В протоколе отмечают следующие характеристики.

1. Величина колоний определяется ее диаметром (крупные – диаметром 4-6 мм и более, средние – 2-4мм, мелкие – 1-2мм и точечные – менее 1мм).

2. Форма колоний (правильная круглая, неправильная амебовидная, розеткообразная, ризоидная - корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев и т.п.).

3. Степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).

4. Структуру колоний. По характеру структуры различают следующие виды ко­лоний:

· гиалиновые - бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

· зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко - и грубозернистые;

· нитевидные или волокнистые, характеризующиеся на­личием длинных, густо переплетающихся нитей в толще ко­лонии. Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

5. Цвет колонии определяется пигментом, который проду­цирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды мик­робов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

6. Характер поверхности (шероховатая, блестящая, матовая, сухая, влажная, гладкая, радиально или концентрически исчерченная).

7. Характер контура края. Различают ровные края в виде четко выраженной ли­нии и неровные. Последние делят на:

· фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округ­лых или уплощенных зубцов правильной формы;

· волнистый край, который несколько отличается от фе­стончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

· эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

· бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки. В некоторых случаях четко выраженная линия, отграни­чивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

8. Рельеф характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Различают рельеф выпуклый, вдавленный, плоский, конусообразный, куполообразный, плоский с конусовидным центром, с утолщенными валикообразными краями и т. п.

9. Консистенцию колонии , определяющую ее физиче­ское состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:

· пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

· вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей

· волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соот­ветствующей величине и форме колонии;

· хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

Колонии некоторых видов бактерий врастают в толщу питательной среды, что также определяют бактериологической петлей.

10. Запах - менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. Многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий – молочной сыворотки, нокардий – свежевскопанной земли, протеев – гнилостный запах.

III. План практической работы

1. Изучить культуральные свойства колоний, выросших на МПА (просмотр посевов сделанных на предыдущем занятии)

2. Изолированную колонию (чистую культуру) отсеять (штрихами) на среду накопления (скошенный МПА)

3. Изучить и зарисовать характер роста различных бактерий на простых и сложных питательных средах

4. Заполнить таблицу « Классификация микроорганизмов по типам дыхания»

5. Решить ситуационные задачи

Метод штриховых посевов сегодня используется в микробиологических лабораториях чаще всего. Материал, который содержит микроорганизмы, набирают бактериологической петлей и наносят на поверхность питательной среды возле края чашки. Снимают избыток материала и проводят занял его параллельными штрихами от края к краю чашки. Спустя сутки инкубации посевов при оптимальной температуре на поверхности чашки вырастают изолированные колонии микробов.

Метод штрихов

Для получения изолированных колоний можно использовать занял тампоном, которым проводили забор исследуемого материала. Несколько приоткрывают чашку Петри с питательной средой, вносят туда тампон и осторожными движениями втирают материал в поверхность чашки, возвращая постепенно тампон и чашку.

Таким образом, существенное преимущество методов пластинчатых разведений Коха, Дригальского и штриховых посевов заключается в том, что они создают изолированные колонии микроорганизмов, которые при инокуляции на другую питательную среду превращаются в чистую культуру.

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают за внешним видом, консистенцией, цветом, запахом и другим признаками, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предыдущий диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Занял проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя за методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 год. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. При потребности исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалинови, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

Характеризовать колонии можно за разными признаками. За величиной (диаметром) их разделяют на больших (4-6 мм и больше), средних (2-4 мм), мелких (1-2 мм), карликовых или точечных (меньше 1 мм). Форма колоний может быть самой разнообразной: правильно круглая, неправильная (амебоподибна), ризоидна. Они бывают прозрачными, что пропускают светло, и мутными.

За рельефом и контуром формы в вертикальном разрезе колонии разделяются на плоских, выпуклых, куполообразных, краплеподибни, конусообразные, плоскоопукли, плоские, что стелются по поверхности среды, с вдавленным центром, из припиднятою в виде соска серединой.

Поверхность колоний может быть матовой или блестящей, с глянцем, сухой или влажной, гладкой и блестящей или шершавой. Гладкие и блестящие колонии помечают как S-формы (smooth –гладкий и блестящий), а шершавые – R-формы (rough – шершавый, неравный).

Форма шершавых поверхностей также может быть разнообразной: морщинистой, гирозной, бородавчатой, шагреневой, иметь радиальную исчерченность и тому подобное.

Подавляющее большинство микроорганизмов образуют бесцветные колонии или мутно молочного цвета. Однако некоторые из них формируют цветные колонии. Их цвет определяется пигментом, который синтезируют бактерии: белые, кремовые, желтые, золотистые, синие, красные и тому подобное.

При доторканни к колонии петлей можно определить ее консистенцию: пастообразная, вязкая или слизистая, сухая, хрупкая и тому подобное.

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают за методом Грамма для изучения морфологических и тинкториальних свойств возбудителей, исследуют подвижную бактерий в “висячей” или “раздавленой” капле. Эти признаки имеют чрезвычайно большое диагностическое значение при характеристике отдельных видов микроорганизмов.

Остатки исследуемых колоний осторожно, не касаясь других, снимают из поверхности среды и засевают на скошенный агар или на секторы чашки Петри с питательной средой для получения чистой культуры. Пробирки или чашки с посевами помещают в термостат при оптимальной температуре на 18-24 год.

Сегодня, как правило, бактериологи пытаются пользоваться стандартными сухими питательными средами, которые выпускает микробиологическая промышленность. Такие среды позволяют существенно улучшить результаты микробиологических исследований и стандартизировать их.

На жидких питательных средах бактерии также могут расти по-разному, хотя особенности проявлений роста более бедны, чем на плотных.

Бактерии способны вызывать диффузное помутнение среды, цвет его при этом может не изменяться или приобретает цвет пигмента. Такой характер роста чаще всего наблюдается в большинстве факультативно анаэробных микроорганизмов.

Порой происходит образование осадка на дне пробирки. Он может быть крошкообразным, гомогенным, вязким, слизистым и др. Среда над ним может оставаться прозрачной или становиться мутной. Если микробы пигмента не образуют, осадок имеет сирувато-билий или желтоватый цвет. Подобным чином растут, как правило, анаэробные бактерии.

Пристеночный рост проявляется образованием хлопьев, зерен, прикрепленных к внутренним стенкам пробирки. Среда при этом остается прозрачной.

Аеробные бактерии имеют тенденцию к поверхностному росту. Часто образуется нежная бесцветная или голубоватая пленка в виде едва заметного налета на поверхности, которая исчезает при стряхивании или взбалтывании среды. Пленка может быть влага, толстая, иметь вязанку, слизистую консистенцию и прилипать к петле, тянется за ней. Однако, встречается и плотная, сухая, хрупкая пленка, цвет которой зависит от пигмента, который производится микроорганизмами.

В случае необходимости изготовляется мазок, окрашивается, исследуется под микроскопом, а микроорганизмы засеваются петлей на поверхность плотной питательной среды для получения изолированных колоний.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его за методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размеров и тинкториальних (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже за внешним видом и особенностями их роста можно сделать вывод о виду выделенных возбудителей. Определение вида бактерий за их морфологическими признаками называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей за их культуральными признаками называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виду выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

Чаще всего исследуют сахаролитические, протеолитические, пептолитические, гемолитические свойства, образования ферментов декарбоксилаз, оксидазы, каталазы, плазмокоагулазы, ДНК-азы,фибринолизина, восстановление нитратов в нитриты и тому подобное. Для этого существуют специальные питательные среды, которые засевают микроорганизмами (пестрый ряд Гисса, МПБ, свернутая сыворотка, молоко и др.).

Запомните этапы выделения чистых культур аеробних бактерий:

1 - макро- и микроскопическое изучение исследуемого материала и посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний.

2 - макро- и микроскопическое изучение колоний и пересев их на скошенный агар для получения чистой культуры;

3 - проверка культуры на чистоту и ее идентификация;

4 - вывод о выделенной культуре.

9. Методы культивирования и идентификация анаэробов. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий.

Все микроорганизмы по типу дыхания разделяются на две основных группы: аеробни (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae и тому подобное) и анаэробные (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens и др.) . Если материал, из которого следует выделить анаэробные возбудители, предварительно прогреть, а затем культивировать в анаэробных условиях, то вырастут именно эти бактерии.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий

В лабораторной практике часто придется работать с анаэробными микроорганизмами. Они более прихотливы к питательным средам, чем аэробы, чаще нуждаются в специальных ростовых добавках, требуют прекращения доступа кислорода при их культивировании, длительность роста их длиннее. Потому работа с ними более сложна, требует значительного внимания бактериологов и лаборантов.

Важной является защита материала, который содержит анаэробные возбудители от токсичного влияния атмосферного кислорода. Потому материал из очагов гнойной инфекции рекомендуется забирать во время их пункции с помощью шприца, время между взятием материала и посевом его на питательную среду должно быть максимально коротким.

Поскольку для культивирования анаэробных бактерий используют специальные питательные среды, которые не должны содержать кислорода и имеют низкий окислительно восстановительныйпотенциал (-20 -150 мВ), к их составу вводят индикаторы – резазурин, метиленовий синей и тому подобное, которые реагируют на смену этого потенциала. При его росте возобновлены бесцветные формы индикаторов изменяют свой цвет: резазурин окрашивает среду в розовый цвет, а метиленовий синей – в голубой. Такие изменения свидетельствуют о невозможности использования сред для культивирования анаэробных микробов.

Способствует снижению окислительно восстановительного потенциала введения в среду не меньше 0,05 % агару, который, увеличивая его вязкость, способствует уменьшению поступления кислорода. Это, в свою очередь, достигается еще и использованием свежих (не позже двух часов после изготовления) и редуцируемых питательных сред.

Следует учесть, что через особенности бродильного типа метаболизма анаэробных бактерий они требуют более богатых на питательные компоненты и витамины сред. Чаще всего используют сердечно мозговой и печеночный настои, соевые и дрожжевые экстракты, гидролитичний перевар казеина, пептон, триптон. Обязательным является добавление факторов росту, таких как твин-80,гемин, менадион, цельная или гемолизированная кровь.

Методы создания анаэробных условий. Учитывая, что свободный молекулярный кислород является токсичным для облигатно-анаэробных бактерий, обязательным условием культивирования таких микроорганизмов является ограничение его доступа. Существует ряд методов (механических, физических, биологических), которые позволяют это обеспечить.

Физические методы. 1. Перед посевом бактерий на питательную среду его обязательно регенерируют для удаления избытка растворенного кислорода. С этой целью среду кипятят в течение 15-20мин на водяной бане, а затем быстро охлаждают к необходимой температуре.

2. Для предупреждения проникненя кислорода в среду его заливают слоем стерильного вазелинового масла или парафином.

3. Столбик питательной среды в пробирках должен быть достаточно высоким (10-12 см). Кислород, как правило, дифундирует в толщу столбика на глубину до 2 см, потому ниже создаются благоприятные условия для культивирования анаэробных микробов.

4. Эвакуационно заместительный метод заключается в использовании анаэростатов. Они представляют собой герметические металлические или пластмассовые банки, из которых можно выкачать кислород и заменить его инертным газом (гелий, азот, аргон). Допускается использование трехкомпонентной газовой смеси, которая состоит из 80 % азота, 10 % диоксиду углерода и 10 % водорода. Порой допустимым считается использование природного газа. Для поглощения кислорода, который остается в анаэростате, используют палладиевые катализаторы. С целью поглощения водяной пары используют хлорид кальция, силикагель и тому подобное, которые помещают на дно анаеростата.

Химические методы. 1. Использование веществ, способных поглощать кислород. С этой целью допустимым является применение щелочного раствора пирогаллола. При этом учитывают поглощающую активность вещества: на 100 мл емкости герметического сосуда, в котором находятся чашки Петри, используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 N раствора гидроксида натрия.

Кислородосвязывающий эффект имеет также гидросульфит натрия (Na2S2O4). Для связывания кислорода в 1 л воздуха используют смесь, которая состоит из 100 мл свежего 20 % растворуNa2S2O4 и 16 мл 50 % гидроксида калия.

2. Применение веществ-редуцентов. Учитывая, что рост облигатно-анаэробных бактерий происходит в средах с низким уровнем окислительно восстановительного потенциала, к ним добавляются специальные восстановители: цистеин (0,03-0,0,5 %), тиогликолевую кислоту или тиогликолат натрия (0,01-0,02 %), сульфид натрия, аскорбиновую кислоту (0,1 %), разнообразные сахара.

Функции обновителей могут выполнять кусочки паренхиматозних органов животных (печенка, почки, сердце) или даже растений (картофель, другие корнеплоды).

Степень поглощения кислорода или степень возобновления среды измеряют или электрометрически или с помощью индикаторов (резазурин, нейтральный красный, феносафранин).

3. Использование специальных газогенерирующих систем, которые позволяют создать бескислородные условия в микроанаеростатах, транспортных пластиковых пакетах и тому подобное. Одной из самых распространенных есть система “Gas Generating Box”. В ее состав входят химические генераторы водорода (борогидрит натрию) и углекислого газа (таблетки бикарбоната натрия и лимонной кислоты), а также палладиевый катализатор, который поглощает кислород.

Чашки с посевами помещаются в микроанаеростат, на дне которого находится слой палладиевого катализатору. Кончик пакета “Gas Generating Box” надрезают ножницами, и у него наливают 10-15мл воды. Пакет располагают в микроанаеростати. Через 15-20 мин в нем создаются анаэробные условия. Водород, который выделяется, взаимодействует с кислородом, образовывая воду, а углекислота продуцируется при взаимодействии бикарбоната натрия с лимонной кислотой.

Биологические методы. 1. Метод Фортнера. Метод заключается в совместном культивировании на одной среде аэробних и анаэробных микроорганизмов. Сначала по диаметру чашки вырезаютполоску агару шириной до 0,5-1,0 см. С одной стороны засевают исследуемый материал, что содержит анаэробные возбудители, а из другого – микробы, которые являются индикатором анаэробных условий (Serratia marcescens или “чудесная палочка”). Края чашки парафинируют или закрывают пластилином. Через некоторое время на поверхности среды вырастают колонии как аэробных, так и анаэробных микробов. При поглощении кислорода Serratia marcescens дает рост бледно-розовых или бесцветных колоний, а при нарушениях герметичности – ярко-красные. На другой половине чашки вырастают колонии анаэробных микробов.

2. Метод Хеннеля (“часовых стекол”). Он является своеобразной модификацией предыдущего. Материал, который содержит анаэробные возбудители, засевается на поверхность питательной среды диаметром 2-2,5 см. Сверху он покрывается “часовым стеклом”, заполненным слоем МПА и засеяным Serratia marcescens. Аеробни микробы, поглощая кислород, создают условия для благоприятного роста анаэробных возбудителей.

В высоко специализированных лабораториях пользуются специальной анаэробной техникой, которая включает использование питательных сред без кислорода с обновителями, выполнения посевов и пересеваний в атмосфере инертных газов, углекислоты и тому подобное.

За последние годы созданы стационарные анаэробные боксы, которые содержат все необходимое для создания анаэробных условий культивирования, включая термостаты. Как правило, такие камеры заполняются трикомпонентною газовой смесью. Бактериолог работает в камере, находясь внешне, применяя резиновые рукавицы, вмонтированные у нее. Такое оборудование имеет неопровержимые преимущества, которые заключаются в том, что полностью исключается контакт кислорода с исследуемым материалом.

Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов

Учитывая современное развитие микробиологической науки, выделять и идентифицировать культуры анаэробных микроорганизмов можно аналогично аеробним бактериям. Обязательным при этом есть соблюдение на всех этапах исследования условий анаэробиоза, используя для этого трикомпонентну газовую смесь (в определенном соотношении азот, водород и углекислый газ) или систему “Gas Generating Box”.

Однако возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции можно выделять и идентифицировать за другой схемой.

На первом этапе (И день исследования) изучают макроскопические особенности клинического материала, делают мазок и окрашивают его за методом Грама. После этого материал засевают на среду Китта-Тароцци и молоко. Предварительно среду регенерируют на кипящей водяной бане в течение 10-20 мин и охлаждают. Непосредственно после посева материала среду нагревают на водяной бане при 80°С в течение 20 мин для уничтожения вегетативных неспоровых форм микробов. Среды ставят в термостат и при температуре 37 °С культивируют 1-3 сутки.

На втором этапе изучают проявления роста микроорганизмов (помутнение, образование осадка и газа на среде Китта-тароцци, пептонизация молока). Поскольку среда Китта-тароцци сверху залита слоем вазелинового масла для предотвращения доступа кислорода, у него окунают пастеровскую пипетку, набирают жидкость, из которой готовят мазок, крася его за методом Грамма. Под микроскопом в мазке можно видеть большие граммположительные палочкоподобные бактерии. После этого проводят занял материалу за методами Вейнберга или Цейсслера для получения изолированных колоний.

За методом Вейнберга готовят несколько узких высоких пробирок (3-4) с растопленным и охлажденным до 42-45 °С сахарным м’ясо-пептонним агаром. Возможно использование среды Вильсон-блера. Материал из среды Китта-тароцци вносят в первую пробирку с помощью пастеровской пипетки и тщательным образом перемешивают, потом переносят в друге, а дальше – в третью. Для застудневания агара их быстро охлаждают под струей холодной водопроводной воды. За счет этого живые микробные клетки фиксируются в определенных участок агара. После застывания агара пробирки культивируют при оптимальной температуре в течение 1‑2 суток для образования изолированных колоний.

Колонии по Вейнбергу

Содержание каждой пробирки можно, кроме того, всосать в пастеровские пипетки или трубки Виньяль-Вейона, следя, чтобы не было пузырьков воздуха. Последние имеют длину возле 30 см и диаметр 0,5-0,6 см. Верхний конец их, который закрывается ватой, имеет перетяжку, а нижний вытянут в виде капилляра. После заполнения пипетки ее вытянутый конец запаивают и кладут в термостат для культивирования. Через 1-2 сутки в агаре вырастают колонии анаэробных бактерий. Для того, чтобы их изолировать, трубку надрезают напильником на определенном уровне, разламывают, колонию берут бактериальной петлей или иглой, переносят в соответствующую среду.

Для выделения изолированных колоний за методом Цейсслера материал из среды Китта-тароцци или молока наносят петлей или 1-2 капли пастеровской пипеткой на чашку Петри с сахарно-кровяным агаром и делают посев шпателем за методом Дригальского. Не стерилизуя шпатель, засевают вторую чашку, а затем и третью. Чашки переворачивают вверх дном, подписывают, ставят ванаеростат, в котором создают анаэробные условия, а затем – в термостат при температуре 37 °С на 2-3 сутки. На последней чашке вырастают изолированные колонии.

Третий этап исследования начинается с изучения морфологических особенностей колоний, которые выросли в чашках Петри или трубках Виньяль-вейона. Исследуются их форма, величина, цвет, характер краев, рельеф колонии, консистенция и тому подобное. Из колоний готовят мазки, красят их за методом Грама. После этого колонии отсевают в среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. Посевы инкубируют определенное время при оптимальной температуре.

На четвертом этапе обращают внимание на особенности роста чистой культуры возбудителей на соответствующих средах, проверяют ее на чистоту и проводят идентификацию. Идентифицируют выделенные чистые культуры анаэробных микроорганизмов подобно аеробних за морфологическими, культуральными, биохимическими и биологическими признаками. Обязательно используют определение токсигенних свойств возбудителей в биологичниий пробе и реакции нейтрализации на лабораторных животных. В некоторых случаях определяют антигенные свойства микроорганизмов.

Таким образом, на основании изучения разнообразных свойств микроорганизмов делается вывод о принадлежности их к тому или другому виду.

Среды для культивирования анаэробных микроорганизмов

Среду Китта-Тароцци готовят на основе бульйона Хоттингера, к которому добавляют кусочки бычьей печенки или мяса. Стерилизуют его при 1 атмосфере в течение 30 мин. Активная реакция среды – 7,4-7,6. После посева материала среду заливают сверху слоем вазелинового масла толщиной до 1 см.

Анаэробный кровяной агар готовят на основе еритрит-агара. В его состав входят также специальные добавки: среда 199 (10 %), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1 %), метадион (10 мкг/мл), цитратнакровь (до 5 %) и тому подобное. После стерилизации его разливают в чашки Петри. Используют не позже, как через 2 год после изготовления.

Желтковый агар. В растопленную и охлажденную до 56-60 °С среду на основе еритрит-агара добавляют суспензию куриного желтка (20 %), глюкозу (0,2 %), гемин (10 мкг/мл) и разливают в чашки Петри. Среду используют для определения лецитиназнои активности возбудителей, в частности C. perfringens. При наличии лецитиназы вокруг колоний образуются зоны помутнения.

Коммерческая среда для контроля стерильности. Его можно использовать в качестве транспортное. Для улучшения роста анаэробных бактерий к его составу можно вводить специальные добавки, такие как среда 199, гемин, твин-80, метадион, цитратна кровь и тому подобное.

Среда Вильсон-блера. Его готовят на основе растопленного и охлажденного до 60 °С 1 % сахарного (глюкоза) МПА рН 7,4 с добавлением на 100 мл 10 мл стерильного 20 % раствору сульфита натрия и 1 мл 8 % раствору хлорида железа. Готовую среду не стерилизуют.

Его используют для ускоренной диагностики газовой анаэробной инфекции, вызванной Clostridium рerfringens. Уже через 1-2 год наблюдают изменение среды: оно чернеет в результате возобновления сульфита натрия в сульфат, который взаимодействует с хлоридом железа, образовывая сульфид железа. Появляются также разрывы агара в результате интенсивного газообразования.

Лакмусовое молоко. Готовят среду из свежего молока. Предварительно его кипятят и оставляют в прохладном месте на одни сутки. Снимают верхний слой жира и процедуру повторяют. Молоко фильтруют, и 10 % раствором бикарбоната натрия доводят рН до 7,2. Перед стерилизацией к молоку добавляют 5-10 % лакмусовой настойки и идентичное количество 10 % раствору бикарбоната натрия, чтобы пена молока приобрела сине-фиолетовый оттенок. При пидлужуванни молока оно становится сине-фиолетовым, при пидкислюванни – розовым вплоть до красного.

10. Методы промышленного культивирования бактерий.

Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы:

Культура микроорганизмов;

Питательная среда;

Аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;

Средства контроля и управления процессом.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства препаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроор-

ганизмов. Так, при производстве бактериальных препаратов целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой, – антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную смесь.

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, способ культивирования называют поверхностным.

Когда же микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, культивирование называют глубинным (жидкофазным). В таком случае кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания.

Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд/см-3, а при применении принудительной аэрации урожайность достигает 50-60 млрд/см-3.

2. Процесс легко управляем. С целью длительного поддержания роста и размножения микроорганизмов в процессе их культивирования дополнительно вводят углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста.

Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования.

3. Процесс максимально технологичен.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах (ферментерах) складывается из следующих этапов:

Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;

Приготовление посевной микробной культуры;

Приготовление и стерилизация питательных сред;

Подготовка биореактора к посеву;

Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

Стерилизацию оборудования и коммуникаций;

Приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др.

Остановимся на каждом из этапов культивирования.

Эталонные штаммы микроорганизмов хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНИКИ (Всесоюзный государственный научно-исследовательский институт клеточной инженерии) ветеринарных препаратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины.

Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНИКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфологическими, специфическими и биологическими свойствами. Основными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.

Производственные, эталонные штаммы должны сохранять

генетическую стабильность антигенных, иммуногенных и дру-

гих присущих им биологических свойств на протяжении 10-20

последовательных пересевов как in vivo, так и in vitro.

Обычно производственное культивирование микроорганизмов осуществляется в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости, например, во флаконе емкостью 100-200 см3, заполненные по 50-150 мл производственной средой. Затем из флаконов делают высевы в большие емкости (бутыли объемом 18-20 л). При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вносят в реактор и называют посевной (маточной) культурой. При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10% по объему. Посевные микробные культуры также контролируются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств, а также на отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

11. Международная классификация и характеристика ферментов микроорганизмов.

Ферменты, образу­емые бактериальной клеткой, могут локали­зоваться как внутри клетки - эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду - экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь ис­точниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепля­ют крупные молекулы пептидов, полисаха­ридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализо­ваны в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в про­цессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и - в некоторых слу­чаях - для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности поль­зуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзофермен­тов можно определить при помощи диффе­ренциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред.

По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов согласно иерархической классификации ферментов (КФ, EC - Enzyme Comission code). Классификация была предложена Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Каждый класс содержит подклассы, так что фермент описывается совокупностью четырёх чисел, разделённых точками. Например, пепсин имеет название ЕС 3.4.23.1. Первое число грубо описывает механизм реакции, катализируемой ферментом:

§ КФ 1: Оксидоредуктазы , катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа.

§ КФ 2: Трансферазы , катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ.

§ КФ 3: Гидролазы , катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза.

§ КФ 4: Лиазы , катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов.

§ КФ 5: Изомеразы , катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.

§ КФ 6: Лигазы , катализирующие образование химических связей между субстратами за счёт гидролиза АТФ. Пример: ДНК-полимераза.

Будучи катализаторами, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакции, поэтому, например, лиазы способны катализировать и обратную реакцию - присоединение по двойным связям.

12. Роль ферментов в идентификации бактерий. Методы определения гликолитических и протеолитических ферментов бактерий. Дифференциально-диагностические среды (моносубстратные и полисубстратные).

Похожая информация.